mRNA 자체는 PCR의 기질이 될 수 없습니다. 따라서 RT반응으로 mRNA로부터 cDNA를 합성할 필요가 있습니다. RTase는 RNA-dependent DNA Polymerase 활성을 가져 mRNA를 주형으로 상보적인 cDNA를 합성 (1st strand 합성)하고, 동시에 DNA-dependent DNA polymerase 활성을 가져 합성된 cDNA의 complementary strand를 합성할 수 있습니다. RT반응에서는 통상 avian myeloblastosis virus (AMV) 유래와 molony murine leukemia virus (MoMLV) 유래의 2종류 RTase가 이용됩니다. AMV 유래 RTase는 상기의 2개 활성뿐만 아니라 mRNA : cDNA hybid를 강력하게 분해하는 RNase H 활성을 가지므로, 1st strand 합성이 저해되면서 긴 cDNA를 합성할 수 없다는 단점을 가집니다. 한편 MoMLV 유래 RTase는 RNaseH 활성이 비교적 약하므로 이론적으로는 긴 DNA 합성이 가능하지만, 반응의 최적온도가 37‘C로 AMV 유래 RTase의 42’C보다 낮으므로 주형 mRNA가 복잡한 고차구조를 가지는 경우에는 cDNA의 신장반응이 저해됩니다.
RT반응의 primer는 목적에 따라 oligo dT 12-18 primer, 특정 염기서열에 대한 상보적인 primer, random 6mer primer 등의 3종류를 이용할 수 있습니다. full-length cDNA를 얻고자 하는 경우에는 oligo dt 12-18 primer가 유용합니다. Target mRNA의 양이 극히 적을 것으로 예상되는 경우에도 oligo dt 12-18 primer는 동일 mRNA의 poly A tail의 다양한 부위와 결합하여 복수의 신장반응을 개시할 수 있습니다. 또한 RT-PCR 기법에 기초한 DPA (differential display analysis)를 할 때에는 RT 산물을 일차정제 분획하는 목적으로 oligo dt 12-18 primer 3‘말단에 A,C,G,T를 다양한 조합으로 2 염기 정도 붙인 primer를 이용합니다.
RT반응으로 얻은 cDNA를 주형으로 PCR을 실시함으로써 mRNA를 검출할 수 있습니다. mRNA를 고감도로 검출하고자 하는 경우에는 방사성 동위원소를 이용한 PCR을 합니다. 여기에는 표식 primer를 이용하는 경우와 표식 nucleotide를 이용하는 경우의 2가지 방법이 있습니다. 일반적으로 방사성 동위원소를 사용하는 PCR은 검출감도가 높으므로 반응을 아주 소량으로 할 수 있기 때문에 방사성 동위 원소나 효소, 기질을 최소량으로 할 수 있습니다. mRNA의 검출을 목적으로 하는 경우에는 PCR을 30 cycle 정도 돌립니다. 한편 mRNA의 정량을 목적으로 하는 경우에는 PCR산물이 지수함수적으로 증가하는 cycle 수를 단편별로 예비실험을 통해 결정해야 하며 통상 21-25 cycle을 돌립니다.
먼저 RT-PCR을 돌립니다. 계산된 농도대로 Oligo dT, RNA, DEPC-dH2O를 순서대로 넣고, pipetting 한 후 ice에 넣습니다. PCR 기계에 tube를 넣고 94‘C 2min에서 반응시킵니다. RNA의 poly A tail에 oligo dT가 붙는 과정입니다. 이 후, RT-1이 돌아가는 동안에 mixture를 만들어 줍니다. 반응 후에 꺼내어 ice에서 식혀줍니다. 각 tube에 mixture를 10람다 씩 넣고 37’C, 1hr, 95’C, 10min에서 반응시킵니다. cDNA가 합성이 완료됩니다.