이번 실험에서는 protein quantification and protein enzyme activity 로 TEV protease를 정량 하는 법에 대해 실험하였습니다. 저 저번 실험의 전반적인 protocol에 대해 정리하고 실험 결과 및 여러 의문점에 대해 이야기 해보겠습니다.
첫 번째로 1.5ml tube에 다음과 같이 용액을 넣어줍니다. BSA stock은 단백질 표준 stock으로 1.6 mg/ml를 초기농도로 잡고, 진행하였습니다. 첫 용액에서 20ul을 따서 새 tube에 옮긴후 DW를 20ul을 넣어주면 농도가 0.8인 용액이 만들어 집니다. 그 이후에도 계속 같은 방법을 이용하여 0.4, 0.2 의 용액을 제조하고, 0.2 에서는 다른 튜브에 옮기지 않고 20ul을 버림으로써 다른 튜브와 용량을 맞춥니다. 마지막으로 0 tube는 DW만 넣어서 준비해 둡니다.
그 다음으로 Reagent A,B를 100ul, 800ul 씩 넣어준 후 votexing으로 섞어줍니다.네 번째로, 상온에서 15분간 incubation 시키고 cuvette으로 800ul 씩 옮겨줍니다.그 후 spectrophotometer로 750nm 에서의 standard와 sample의 absorbance를 측정하여 excel을 통해 standard curve를 그린수 미지시료의 농도를 계산합니다.
이것은 각 농도 별로 측정한 standard의 absorbance를 표로 나타낸 것이고, 오른쪽 그림은 그 표를 바탕으로 standard curve를 그려 추세식을 나타낸 것입니다. Y= 0.262x + 0.0268 식이 나왔으며 이 식에 저희 조가 측정한 E1, E2 값을 x에 대입하여 y값을 계산할 수 있습니다. E1 ( )값을 넣었을 때는 ( ) , E2 ( )값을 넣었을 때는 ( ) 값이 나왔으므로 각각의 protease량의 정량 할 수 있었습니다. 다음으로는 실험 하는 과정에서 생기는 여러 의문점에 대해 알아보겠습니다.
순수분리한 단백질을 정량하는 방법으로 시약을 사용하는 방법을 사용하였는데, 그 외에도 여러 다양한 정량 방법이 존재 합니다. 그 중 하나의 예를 들면 가장 자주 쓰이는 방법이 Fluorescence dye 방법입니다. 단백질에 특이적으로 반응하는 형광 dye를 사옹하여 정량하는 방법으로 uv나 가시광선에서 detection되는 측정값보다 정확합니다. 이 방법을 사용하기 위해서는 실험실에 fluorometer 기기를 구비하여야 합니다. 두 번째로 우리는 이번 실험에서 순수 분리한 TEV protease 의 정성적인 검사를 하지 않았는데 그 이유는 단백질 정성검사에 필요한 시약들이 단백질에 예민하게 반응하기 때문에 단백질로 이루어진 우리 피부에도 반응하여 착색을 일으킬 수 있기 때문에 주의하며 실험해야 하기 때문입니다.
만약 정성 실험을 하게 된다면 주로 Ninhydrin반응을 이용하는데 단백질의 구성성분인 아미노산의 NH2기는 가수분해 되기 어려우나 산화에 의해 쉽게 분리됩니다. 따라서 ninhydrin과 함께 가열하면 탈 아미노 작용이 일어나게 되고 이때 청자색을 띄게 됩니다, 오른쪽 아래 지문 사진은 ninhydrin이 매우 예민하게 작용하여 지문을 찾아내는 데에도 이 시약을 사용할 수 있다고 알게 되어 삽입한 그림입니다.