예전에 포스팅을 통해 openOOO을 소개했고, 이를통해 직접 OOO 기계를 만들어볼수 있습니다. 드론자세제어등 피드백제어에 쓰이는 PID제어에 대해서도 설명을 했고,
사실 OOO는 온도제어가 거의 모든 것이라고 할 수 있습니다.
이번에는 직접 OOO을 해보도록 하죠.
DNA를 추출하는 방법은 대상 세포의 종류에 따라 차이가 있습니다.
대장균은 꼬마선충의 세초에 비해 더 쉽고, 식물세포는 더 복잡한 과정을 거칩니다.
대장균과 같은 세균은 복잡한 처리를 하지 않고도 세제 성분만으로 쉽게 세포를 깰 수 있습니다.
꼬마 선충은 여러가지 장점으로 연구분야에 많이 활용됩니다. 현미경으로 관찰해 보시면 왜 elegans인지 아실 겁니다.
팁을 이용해 예쁜 꼬마선충을 e-tube에 넣는다.(대장균의 경우 Proteinase K를 생략하고, 시약도 반으로 줄인다.)
세포 용해액(Al buffer) 300μl과 단백질 분해효소(Proteinase k) 1μl를 넣는다.
→55℃ Heat block에 1시간 동안 넣어둔다.식힌 뒤에 RNase(RNA 분해효소) 1μ를 넣는다.
→37℃ Heat block에 15분간 둔다.단백질 응고액(PP buffer)을 넣고 잘 섞는다.
→단백질 응고액(PP buffer)를 10분이상 돌린다.찌꺼기는 버려 두고 상층액만 새 E-tube에 옮기고 이소프로파놀(단백질 응고액(PP buffer), 없는 경우 에탄올도 가능)을 300μl 넣는다.
→원심분리기를 10분이상 돌린다.이번에는 상층액을 버린 후에 70% 에탄올을 300μl 넣는다.
6번 반복
에탄올이 남지 않도록 말린 후에, 증류수 등을 50μl를 넣어 dna를 녹인다.
- 세균과 달리 동물 조직은 세포끼리 단단하게 묶여 있기 때문에, 가능한 작게 잘라준 뒤 단백질 분해 효소를 처리해 주어야 쉽게 깨뜨릴 수 있습니다. 이 효소는 55℃ 부근에서 가장 잘 작동합니다.
- RNA 분해효소는 37℃ 부근에서 가장 잘 작동하지만 55℃ 부근에서는 고장납니다. 따라서 단백질 분해효소 처리후 반드시 식혀야
RNA를 제대로 제거힐 수 있다.(깨끗한 DNA 추출) - 세포 용해액에는 주로 세제 성분과 DNA 분해효소 억제제가 들어 있다.
- DNA는 에탄올 농도가 높을때 하얗게 침전된다.
OOO 프로토콜
OOO premix( OOO반응이 가능하게 모든 효소와, dNTP, 버퍼 등등이 들어있음.)에 추출한 dna 2μl를 넣는다.
→OOO premix에는 Taq-polymerase , dNTP, OOO reaction buffer가 들어있다.
OOO reaction buffer는 pH 안정화(Tris-HCl), 효소 활성의 보조인자 공급(MgCl2나 MgSO4), 효소 안정화(BSA, KCl, Tween20, Tripton X-100)의 역할을 한다.Forward primer (3'-5'에 붙음)2μl를 넣는다.
Reverse primer 2μl를 넣는다.
증류수 10μl를 넣고 튜브를 닫고 잘 섞이도록 가볍게 쳐 준다.
OOO튜브 아래로 용액이 모이도록 spin down.
OOO기계에 넣는다.
a. Pre-denaturation : 95℃ 5min
→ 예열, 단일가닥으로 풀어줌
b. Denaturation : 95℃ 30sec
→ 열을 가해 단일가닥으로 풀어줌
c. Annealing : 60℃ 30sec
→ Primer가 자리를 찾아가 붙는 과정
d. Extension : 72℃ 1min
→ DNA 합성이 일어남
e. Fin-Extension : 72℃ 10min
→ 중합효소가 충분히 반응하도록 함
b, c, d 과정을 34cycle 반복
→ 실제로 94℃ 3분, 94℃ 20초, 55℃ 201초, 72℃ 40초 31cycle 실시로 충분함.
병맛 노래를 소개합니다.
노래방엔 없어요.
전기영동이나 시퀀싱에 대해선 다음에 알아보도록 하죠.
간단히 설명하면 DNA는 음전하를 띠기 때문에(인산이 음전하를 띰) 전기영동으로 DNA 절편의 크기에 따라 분리할 수 있습니다.
시퀀싱은 보다 여러 설명이 필요하므로.