¡Hola gente bonita! Hoy les traigo una técnica que aprendí estas vacaciones al realizar pasantías en el área de biología molecular. Debo decir que no hay nada más grato que realizar cosas que le gusten a uno y así me siento con la biología. 😃
Colocando muestras de ADN en el gel de agarosa
¿Te preguntaras que es la electroforesis?
Es algo muy simple querido amigo, la electroforesis nos permite visualizar los ácidos nucleicos (ADN o ARN) de acuerdo a su tamaño o proteínas de acuerdo a su carga, una vez extraídos sea de una muestra de sangre, de tejido animal, tejido foliar, entre otros.
Extracción de ácidos nucleicos a partir de una muestra de sangre
Hoy te hablaré de electroforesis horizontal para ADN y ARN mediante el uso de gel de agarosa, nos permitirá ver alguna mutación en el gen partiendo del producto de PCR (Polymerase Chain Reaction) para amplificar los genes de interés, esta técnica es ampliamente usada en biología molecular.
Algunos materiales necesarios en una electroforesis
Para ello precisamos de un equipo el cual consiste en una cámara electroforética y una fuente de poder la cual por diferencia de voltaje emitirá un campo eléctrico que hará que migren los ácidos nucleicos que se encuentren depositados en los pozos del gel de agarosa.
El campo eléctrico se puede modificar mediante la fuente de poder cambiando el voltaje y el tiempo de duración (mucho voltaje no permite la correcta migración de los ácidos nucleicos) , la cámara electroforética está llena de un líquido, necesario para la conductividad eléctrica, este es el buffer TAE (Tris, Ácido acético y EDTA) permite mantener las moléculas de ADN con una carga negativa uniforme y constante mientras se realiza la carga electroforética, el EDTA evita la degradación del ADN durante la preparación la electroforesis, este buffer TAE 1X permite que no se sobrecaliente a voltajes altos además de una rápida migración de ADN.
Necesitamos un guía al momento de colocar nuestras muestras de ADN y ARN (ya que son incoloras) este es el buffer de carga está compuesto de glicerol y colorante, su importancia es: el glicerol permite que la muestra se asiente en el pozo y el colorante (puede ser azul, morado, verde,…) además de colorear la muestra y no perder el orden de los pozos al encender la electroforesis presentará un frente de corrida lo cual nos permitirá visualizar cuanto ha corrido la muestra.
Buffer de carga
Una vez hayan corrido los ácidos nucleicos necesitamos visualizarlos para ello es importante el bromuro de etidio este compuesto se intercalará entre la muestra de ADN se excitará con luz UV lo cual nos permitirá la visualización de las bandas, hay laboratorios donde usan otros compuestos como SYBR Green, entre otros, los cuales no tienen este efecto mutagénico ni son agentes intercalantes del ADN pero son mucho más costosos.
Por último pero no menos importante necesitamos una matriz por donde correrá la muestra este es el gel de agarosa, el cual presenta poros por donde migraran los ácidos nucleicos de acuerdo a la concentración de agarosa estos serán de mayor o menor tamaño, elegimos la concentración de agarosa según el tamaño de nuestro producto.
Cuando hablo de tamaño de la muestra me refiero al número de pares de base (pb) que presenta ese gen. Por ejemplo en un gel de 0,8% de agarosa significa que tendrá los poros del gel más grandes ideal para que pueda moverse un producto con gran numero de pares de bases, en cambio agarosa al 3% presentará poros de menor tamaño es ideal para productos con menor número de pares de base.
Preparación del gel de agarosa
Materiales:
-Agarosa
-Cilindro graduado
-Balanza
-Matraz
-Microondas
-Bromuro de etidio
Para gel de agarosa al 3%
-Se pesa 3 gr
-Se mide 100ml de Buffer TAE 1x
-Se agrega los 100ml al matraz mas los 3 gr de agarosa
-Se lleva al microondas el matraz y se va calentando cada 20 seg evitando su ebullición
-Se saca una vez que la solución este traslucida
-Agregar 10uL de Bromuro de etidio agitar suavemente
-Vertir la mezcla en el recipiente para hacer los geles
-Colocar los peines
-Dejar secar aproximadamente 10 min
Lo mejor es usar los geles frescos, se pueden almacenar a 4°C en la nevera hasta una semana pero dependerá del grosor del gel que mantenga su integridad, luego de este tiempo es probable que el gel se ponga débil y presente huecos en los pozos.
Almacenamiento de geles de agarosa
Aquí un resultado de electroforesis:
Se necesita un sistema de documentación de geles, en el cual se coloca el gel una vez terminada la electroforesis y por luz UV se tomará una imagen que podemos visualizar.
En la imagen podemos ver varios pozos marcados con C-, C+, Gen A, Marcador y Gen B. Es importante indicar cuales son las muestras colocadas en los pozos del gel ya que es importante para su posterior estudio.
C- o control negativo es una muestra que no lleva el gen de interés que estamos estudiando en este caso Gen A,
C+ o control positivo es una muestra que sabemos que lleva ese gen de estudio.
Gen A es una muestra que estamos amplificando para ese gen.
Marcador es el fragmento de ADN con un peso molecular conocido, en este caso es del Gen A.
Gen B este gen no es del mismo tamaño que el Gen A sino más pequeño por lo que se encuentra a un nivel más abajo del Gen A.
Espero que haya sido de tu agrado este post y la ciencia siga creciendo!
Todas las imágenes son de mi autoría