En cuanto a las enzimas, existe una gran diversidad de genes que codifican a estas catalizadoras biológicas con diversas rutas. Algunas de las más importantes enzimas que actúan en la degradación de HC tenemos a las monooxigenasas y di-oxigenasas (oxidan el esqueleto carbonado), rubredoxina (oxidorreductasa), Deshidrogenasas de alcoholes y aldehídos, AcetilCoA sintasa, alcano hidroxilasas, entre otras. Las cuales trabajando en conjunto logran degradar los hidrocarburos. Pero algunas de las familias de estos genes pueden encontrarse regulados por la presencia de estos compuestos, haciendo que se active la ruta cuando un gen regulador especifico reciba una señal; como es el caso de ALKS.
Se sabe que a medida que transcurre el tiempo de una bacteria hidrocarcuroclastica expuesta a HC, la velocidad de crecimiento disminuye. Ya que los microorganismos degradan o catabolizan compuestos según un orden de complejidad, del más simple al más complejo, podemos decir que existe una mayor complejidad en las fracciones de hidrocarburos del petróleo que comienzan a degradarse a medida que avanza la fase de crecimiento. (Pérez, 2007).
Las primeras fracciones en degradarse serán las más simples, siguiendo el siguiente orden alcanos-lineales > alcanos-ramificados > aromáticos de bajo peso molecular > ciclo alcanos.
Los alcanos lineales de bajo o mediano peso molecular son los primeros en ser metabolizados por la ruta de la β-oxidación, a la cual entran gracias a las enzimas oxidativas como la monooxigenasa, la cual induce el proceso de oxidación terminal en el que el alcano pasa a ser alcohol, luego aldehído y por último en acido carboxílico; Lo mismo ocurre con los alcanos ramificados. Los compuestos aromáticos en cambio presentan diversas rutas metabólicas a través de las cuales se pueden degradar dependiendo de su estructura y el tipo de bacteria. Generalmente la ruta utilizada para estos compuestos son la oxidación y un posterior ataque enzimático para que luego sus intermediarios entren al ciclo de Krebs. (García, 2014).
Los compuestos aromáticos en cambio presentan diversas rutas metabólicas a través de las cuales se pueden degradar dependiendo de su estructura y el tipo de bacteria. Generalmente la ruta utilizada para estos compuestos son la oxidación y un posterior ataque enzimático para que luego sus intermediarios entren al ciclo de Krebs. (García, 2014).
Métodos de aislamiento de bacterias degradadoras de hidrocarburos
Capacidad Hidrocarburoclastica
- Tomar una muestra de suelo sin contaminar.
- Mezclar con un porcentaje de algún HC.
- Remover para homogenizar oxígeno en el suelo.
- Tomamos una muestra mas pequeña de este suelo y mezclamos en solución salina a diferentes tiempos.
- Realizamos una agitación en vortex y luego se procede a una dilución seriada.
- Se siembra cada dilución en placas de Agar Bushnell Haas + %HC.
- Observamos el crecimiento de bacterias en placas.
Producción de Tensoactivos
- Las bacterias crecidas en Agar son aisladas en tubos con caldo nutritivo.
- Incubación de 24 horas a 37°C.
- Transferencia de alícuota a tubo con medio mineral salino con Glucosa.
- Incubación por 3 días a 25°C.
- Centrifugación de tubos con producción de espuma (30 min – 3220rpm).
- Transferimos sobrenadante a un tubo con HC.
- Agitación en vortex y dejamos reposar
- Si vuelve a producir espuma de forma estable es positivo para producción de tensoactivos.
Una vez que hemos determinado si las bacterias son capaces de degradar hidrocarburos procedemos a la identificación de las cepas mediante el uso de pruebas bioquímicas que nos hagan inferir en un genero y especie; o el uso de herramientas moleculares como secuenciación de ADN.
