¡¡¡¡Hola Steemians!!!!
Hoy te traigo otro de los emocionantes post científicos que me encanta compartir con utedes.
Si eres de los que has podido leer los anteriores posts, sabrás que ando en la onda de publicar mis experiencias en los laboratorios de la carrera. Este en particular lo he querido compartir con ustedes, puesto que esta materia fue divertida y el bloque a la cual corresponde esta experiencia la impartió un profesor al cual admiro y respeto en el área de celular. Espero les guste.
Eritrocitos en vasos sanguineos
Transporte celular:
El transporte celular es el mecanismo de regulación del paso de ciertos solutos, iones y moléculas pequeñas a través de la membrana plasmática gracias a propiedades intrínsecas de la misma por su estructura de bicapa lipídica. ( Lodish (2005)). La membrana plasmática está conformada por proteínas integrales las cuales van desde la zona polar a la zona apolar (Lípidica) y las proteínas periféricas solo en la zona polar, las cuales se unen a la superficie por enlaces no covalentes, junto a diferentes lípidos que le dan selectividad a la membrana dispuestos en un modelo de mosaico fluido propuesto por Singer y Nicolson en el año 1972 ( Lodish (2005)) .
Es un mosaico ya que la membrana es asimétrica y es fluido porque se encuentra en constante movimiento. La Permeabilidad por difusión pasiva es el paso de solutos a través de la membrana a favor de un gradiente de concentración sin necesidad de consumir ATP (Alberts (2004)), el paso de ciertos solutos depende de la polaridad de los mismos, su tamaño, su carga, y su constante de partición la cual se define como la afinidad de una sustancia por una fase orgánica/ la afinidad por una fase acuosa (Lodish (2005)).
Generalmente por difusión pasiva van a pasar solutos pequeños sin carga, moléculas no polares, gases (Lodish. (2005)). Para el paso de moléculas más grandes y moléculas cargadas como los iones es necesario canales, transportadores y bombas iónicas. En esta experiencia se evaluó la velocidad de paso de ciertas sustancias a través de la membrana de los eritrocitos, para eso se realizaron ensayos previos con distintas concentraciones solución salina en un modo de observar el grado de la hemolisis (ruptura de la membrana plasmática). Se realizan estos ensayos para realizar una curva de calibración a través del efecto de dispersión de luz.
La célula utilizada en la práctica fueron los eritrocitos, los cuales son células encontradas en el plasma sanguíneo, son abundantes de fácil extracción y poseen una gran flexibilidad para su transporte sanguíneo, debido a la conformación del citoesqueleto subyacente de la membrana plasmática (M. Musielak. (2009))
Ok bien, ya se habló de la definición del transporte un poco del comportamiento celular en distintas soluciones con diferente concentración salina, pero hablemos objetivamente de lo que se pretendía evaluar. En un modo en general se trató del estudio de las propiedades de permeabilidad selectiva de la membrana plasmática de los eritrocitos a través de un ensayo de difusión pasiva con diversos solutos específicos. Además de determinar el grado de hemolisis de los eritrocitos a partir de una curva de calibración
Ensayo de permeabilidad selectiva de la membrana de eritrocitos
Preparación de soluciones y curva de calibración
En un primer paso se prepararon dos suspensiones de eritrocitos, una de 100% de hemolisis (lisis celular) esto con una solución primero hipotónica y luego hipertónica y otra a 0% de hemolisis con una solución isotónica. Por último, con 6 ml de la suspensión con 100% de hemolisis se calibro el valor cero de la densidad óptica del fotocolorímetro. Luego se midió la densidad óptica de la suspensión con 0% de hemolisis.
Para construir la curva de calibración se prepararon soluciones de 25%, 50% y 75% de hemolisis usando combinaciones de las suspensiones de 0% y 100% de hemolisis. A continuación, los resultados de esta primera experiencia.
En la tabla 1 se muestran los volúmenes que fueron utilizados de cada una de las suspensiones de 0% y 100% de hemolisis para poder generar suspensiones con otros porcentajes.
Tabla1. Porcentajes de hemolisis y sus respectivos volúmenes de suspensión
En la tabla 2 se encuentran registradas las densidades ópticas de cada una de las suspensiones con distintos porcentajes de hemólisis. Las cuales fueron medidas a 500nm en el espectrofotómetro. La tabla 3 muestra los respectivos volúmenes utilizados de agua y solución madre de NaCl para poder hacer soluciones de 0, 30, 60, 90, 120, 150 mM.
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La figura 1 muestra una tendencia lineal con un coeficiente de correlación de 0,99 que posee una pendiente negativa lo cual hace referencia que a medida que el porcentaje de eritrocitos lisados aumenta, a causa de la entrada de agua a la célula, la densidad óptica disminuye o que la transmitancia aumenta. Los eritrocitos en su estado normal absorben una determinada cantidad de luz, lo cual ocasiona una disminución en la transmitancia (cantidad de energía que atraviesa un cuerpo por unidad de tiempo); cuando los eritrocitos están lisados, la luz no tiene obstáculos de gran magnitud que impidan su propagación a través de la solución, esto se traduce en un aumento de la transmitancia y un descenso en la densidad óptica.
Figura 2. Ilustración del eritrocito y la presión osmótica
La membrana plasmática es muy permeable al agua y las moléculas pequeñas orgánicas, pero poco permeable a las sales o compuestos iónicos y a las moléculas grandes orgánicas, como los azúcares y los aminoácidos a través de difusión pasiva (Lodish, 2005). Debido a la ósmosis, el agua se mueve a través de las membranas semipermeables desde una concentración baja de soluto (concentración alta de agua) hacia una de concentración alta de soluto (concentración baja de agua) hasta que las concentraciones totales de soluto y, por ende, de agua en ambos lados sean iguales. Cuando la mayoría de las células animales son colocadas en una solución isotónica (es decir, con una concentración total de solutos igual a la del interior de la célula), no hay un movimiento neto de agua hacia adentro o hacia afuera de la célula. Sin embargo, cuando las células son colocadas en una solución hipertónica el agua fluye hacia fuera de la célula y provoca su encogimiento, cuando son colocadas en una solución hipotónica el agua fluye hacia el interior celular haciendo que la célula se hinche (Lodish, 2005).
En consecuencia, al colocar los eritrocitos en una solución solo con agua destilada, se genera una solución hipotónica por lo que las células se hinchan y se revientas dejando salir el contenido intracelular. De la misma manera al añadir a estas células una solución hipertónica, se produce un encogimiento, produciendo salida de hemoglobina.
Construcción de curva de fragilidad de los eritrocitos
Se prepararon distintas soluciones de NaCl, con concentraciones de 0, 30, 60, 90, 120 y 150 mM. Luego a cada una se le añadieron un volumen de suspensión de eritrocitos original mezclando por inversión y luego dejando reposar por 10 minuto. Ya una vez terminado el reposo se midió densidad óptica de cada suspensión con concentraciones distintas. Se determinó el porcentaje de hemolisis de cada concentración usando la curva de calibración generada anteriormente y la densidad óptica registrada para cada una de las concentraciones. Dicho porcentaje de hemólisis de los eritrocitos disminuye a medida que aumenta la concentración de la solución salina (que se aproxima a la concentración isotónica) donde se hace cero al llegar a la concentración isotónica.
Tabla 4. Porcentaje de hemolisis del eritrocito en distintas concentraciones de solución salina.
Fig 3. Hemólisis vs concentración de NaCl (Curva de fragilidad del eritrocito)
En la curva de fragilidad se puede observar una tendencia la cual hace referencia que a menor concentración de sal aumenta la hemolisis en los eritrocitos, donde los eritrocitos expuestos a soluciones muy hipotónicas son lisados en su totalidad. A concentraciones salinas entre 90 y 120mM observamos un cambio drástico en el porcentaje de hemólisis, lo que nos indica que un leve aumento de la molaridad de la solución salina dentro de este rango ocasiona un cambio significativo en el volumen de los eritrocitos (Donato y col, 2015).
Figura 4. Ejemplo de eritrocitos contenidos en distintas soluciones con diferente concentración salina
Este mismo comportamiento sigmoideo se observa en eritrocitos humanos, cuya curva de fragilidad se muestra en la siguiente figura.
Figura 5. Curva de fragilidad osmótica del eritrocito en humanos
Al igual que los eritrocitos de conejo, los glóbulos rojos humanos también poseen un rango de concentración salina en la cual pequeños cambios podría ocasionar un alto porcentaje de lisis. Esto puede observarse cuando el porcentaje de solución salina es poco menos de la mitad. Cabe acotar que aquellas personas que sufren de anomalías en cuanto a la estructura de los eritrocitos (por ejemplo, esferotrocis hereditaria), estos pueden lisarse inclusive cuando se tienen concentraciones relativamente altas de sal.
Pequeños cambios en la concentración de sal suelen ocasionar una alta probabilidad de lisis lo que puede hacer referencia a la estructura de la membrana plasmática, las proteínas del citoesqueleto y la edad del eritrocito. Las membranas naturales de diferentes tipos de células exhiben diversas formas que complementan la función de una célula. La superficie bicóncava, suave y flexible de la membrana plasmática del eritrocito le permite a la célula escurrirse a través de capilares sanguíneos angostos sin romper su membrana. El componente principal del citoesqueleto del eritrocito es la espectrina, la cual le proporciona la elasticidad y flexibilidad necesaria para soportar fuerzas que tienden a romperlo (Lodish, 2005). De esta manera para aquellos eritrocitos que estuviesen jóvenes tendrían una probabilidad de lisis menor que los eritrocitos maduros.
Figura 6. Ilustración de la espectrina en un eritrocito. Extraído de Murray 2010.
Método Cualitativo
Se colocaron en dos pocillos de una placa de microtitulación, dos gotas de sangre a las cuales se le añadió galactosa a una de las gotas y urea a la otra gota de sangre. Se procedió a colocar un papel bajo la placa para determinar a través del tiempo que pasa hasta que podamos ver el papel a través de la gota; si el soluto añadido era un soluto rápido (0-2 min), intermedio (2-10 min) o lento (más de 10 min).
En la tabla 5 colocamos los dos solutos suministrados (galactosa y urea) para evaluar la velocidad de hemolisis de los eritrocitos dentro de estos solutos. Clasificándose la urea como un soluto rápido al hemolizar casi en su totalidad (por ver el papel a través de esta) en un tiempo menor a los 2 minutos (1:53 min). La galactosa se clasifico como soluto lento ya que no penetro rápidamente en el eritrocito lo cual se demostró al pasar más de 10 minutos sin poder ver a través de la suspensión.
Tabla 5. Clasificación de los solutos según el tiempo en hemolizar
Método Cuantitativo
En 1 cubeta Bausch y Lomb se agregó 5,9 ml de galactosa determinado como soluto lento, se le añadió 0,1 ml de suspensión original de eritrocitos. Se realizaron lecturas con el procedimiento de soluto lento, en donde se tomaron lecturas de densidad óptica cada 5 minutos para las primeras 3 lecturas y cada 15 minutos lecturas posteriores hasta llegar a una lectura de 100nm.
Dichos datos son expresados a continuación en la tabla 6.
Tabla 6. Porcentaje de hemolisis a diferentes tiempos con el soluto lento (glucosa)
Fig 7. Curva de % Hemólisis en función del tiempo con respecto a un soluto lento como galactosa.
Teóricamente se habla que la membrana plasmática es una barrera con permeabilidad selectiva que permite el paso de solutos por varios mecanismos, entre ellos la difusión simple (Alberts 2005), mecanismo principal utilizado para los fines de la práctica. A su vez la difusión es un proceso independiente de energía donde un soluto se mueve en favor de un gradiente electroquímico. Los solutos inorgánicos pequeños, como el O2, CO2, Urea y H2O, penetran con facilidad la bicapa de lípidos, al igual que los solutos con coeficientes de partición altos (alta solubilidad en lípidos). Los iones y los solutos orgánicos polares, como los azucares y los aminoácidos, requieren transportadores especiales para entrar o salir de la célula (Lodish, 2005). Es decir, a menor tamaño de la molécula y cuanto más soluble en aceite, más rápidamente difunde a través de la bicapa.
Los solutos suministrados: Urea y Galactosa difirieron en gran escala en los resultados, pues para la urea el tiempo de hemolisis total fue menor de 2 minutos denominándolo “soluto de difusión rápida”. Sin embargo, la galactosa para llegar al 50% de hemolisis se esperó un tiempo aproximado de 40 minutos por lo que ese tiempo fue mayor a 10 minutos, denominándolo así un soluto de difusión lenta.
Fig. 8 estructura de la urea ________ Fig 9 Estructura de la galactosa
Al comparar las estructuras de las figuras 8 y 9 se puede observar que la urea es una molécula pequeña, polar y neutra por lo que la capa de solvatación es pequeña, lo que puede inferir su paso rápido a través de la membrana (Lodish 2005). De modo contrario la galactosa es una molécula polar y de gran tamaño por lo que posee una mayor capa de solvatación reduciendo su coeficiente de partición, es decir, es menos lipofílica, en consecuencia, el soluto no atraviesa la membrana por difusión simple.
Lo que hace pensar que la molécula de galactosa requiere de un transportador para ingresar dentro de la célula o bien, que requiere de cambios en su estructura (lo que generaría un tiempo considerable) en la que la molécula se parezca a la estructura de la glucosa y así poder ingresar a la célula con mayor facilidad.
La glucosa al igual que la galactosa no difunde a través de la bicapa lipídica, por lo que debe ser transportada al interior de la celular. Se han descrito dos sistemas de transporte de glucosa y de otros monosacáridos, como la galactosa y fructosa: los transportadores de sodio y glucosa llamados SGLT (sodium-glucose transporters) y los transportadores de glucosa llamados GLUT (glucose transporters). (Díaz D. y Burgos L., 2002).
Tabla 7. Características de algunos transportadores de monosacáridos. Extraído de: Díaz D. y Burgos L., 2002.
…Ahora bien…
En un modo de recopilar toda la información, se puede llegar a la conclusión de los siguientes aspectos:
• Variaciones pequeñas en la concentración de sal pueden ocasionar cambios significativos de volumen en la célula del eritrocito y en consecuencia causar la lisis. A concentraciones hipotónicas mayor probabilidad de lisis o hemolisis celular en los eritrocitos.
• El paso de moléculas a través de la membrana plasmática por difusión es dependiente de su coeficiente de partición y el tamaño.
• Moléculas pequeñas tanto hidrófobas como polares (Urea) atraviesan la bicapa lipídica, de modo contrario aquellas moléculas grandes como la galactosa no pueden pasar a través de la membrana.
REFERENCIAS
- Alberts et al. (2004). Biología molecular de la célula. Barcelona: Omega. ISBN 54-282-1351-8.
- Díaz Diana y Burgos Luis. ¿Cómo se transporta la glucosa a través de la membrana celular? Departamento de fisiología y bioquímica. Facultad de Medicina. Universidad de Antioquia. Septiembre.2002. Vol 15 numero 3.
- Donato, H y col. 2015. Esferocitosis hereditaria. Revisión. Parte I. Historia, demografía, etiopatogenia y diagnóstico. - Arch Argent Pediatr. 113(1): 69-80.
- Lodish et al. (2005). Biología celular y molecular. Buenos Aires: Médica Panamericana. ISBN 950-06-1974-3.
- M. Musielak. (2009). Red blood cell-deformability measurement: Review of techniques. Clin Hemorheol Microcirc 42(1):47-64.
- Murray, Brender, Botham, Kennelly, Rodwell, Weil.Harper Bioquimica iustrada. 28 edicion, Ed. Mcgraw Hill 2010.
Bueno amigo lector, este es el final.
Si te interesó el tema puedes escribir aca abajito y hacer preguntas o sugerencias.